Die Zweifarbfledermaus gehört zur Familie der Glattnasen (Vespertilionidae).
Ihre Körpergröße beträgt knapp über 6 cm bei einem Gewicht von 13 bis 23 g und einer Flügelspannweite von um die 30 cm. Die Oberseite ist rot- bis dunkelbraun mit grauweißen Haarspitzen und die Unterseite ebenfalls gräulich weiß.
Wie alle Glattnasen bevorzugt auch die Zweifarbfledermaus Spaltenquartiere in Häusern, für die Überwinterung von Oktober bis März werden zum Teil Kellergewölbe bezogen.
In den Wochenstuben, die eher aus kleineren, ein paar Dutzend Tiere umfassende Gruppen bestehen, werden von Mai bis Juli meist zwei Jungtiere pro Weibchen geboren. Die Weibchen besitzen als besonderes Merkmal vier Zitzen, was bei europäischen Fledermäusen einmalig ist.
Während der in den Herbst fallenden Paarungszeit stossen die Zweifarbfledermäuse Zwitscherlaute als Balzrufe aus.
Ihre Ultraschallfrequenz beträgt um die 25 kHz.
Die Nahrung besteht überwiegend aus Fluginsekten, die in bis zu 20 m Höhe über Feldern oder Gewässern gefangen werden.
Sie gilt als Wanderart, die jährlich um die 1000 km zurücklegt.
Das bekannte Höchstalter ist zwölf Jahre.